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實(shí)驗(yàn)室和細(xì)胞工廠在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體污染一直是困擾我們的疑難雜癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染一般能達(dá)到30%，甚至更多，嚴(yán)重干擾了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。因此，定期進(jìn)行支原體檢測(cè)和去除，確保細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)無(wú)支原體存在才能獲得準(zhǔn)確有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

支原體是什么？

支原體是1898年Nocard等發(fā)現(xiàn)的一種類似細(xì)菌但不具有細(xì)胞壁的原核微生物，能在無(wú)生命的人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，直徑50-300nm，能通過細(xì)菌濾器。支原體在過去曾稱之為類胸膜肺炎微生物，1967年正式命名為支原體。

支原體又稱霉形體，為目前發(fā)現(xiàn)的較小較簡(jiǎn)單的原核生物，基因數(shù)量為480。支原體細(xì)胞中唯一可見的細(xì)胞器是核糖體。支原體通常依附在細(xì)胞膜表面，結(jié)構(gòu)也比較簡(jiǎn)單，多數(shù)呈球形，沒有剛性的細(xì)胞壁，因此很多抗生素對(duì)其不起作用。只有三層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞膜，故具有較大的可變性。實(shí)驗(yàn)室常見的種類有：口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、發(fā)酵支原體、人型支原體、唾液支原體、肺支原體和梨支原體等。

支原體污染的原因是什么？

支原體污染一直是困擾實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)的難題，其來(lái)源主要是有以下幾個(gè)方面：

1. 細(xì)胞之間交叉污染；

2. 工作環(huán)境或?qū)嶒?yàn)器材的污染；

3. 實(shí)驗(yàn)者無(wú)菌操作不佳；

4. 培養(yǎng)基或其他試劑污染；

5. 制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染；

支原體污染的危害是什么？

細(xì)胞培養(yǎng)中的污染類型很多，其中細(xì)菌和真菌造成的污染相對(duì)比較容易檢測(cè)、預(yù)防和去除，然而支原體造成的污染很難察覺，即使生長(zhǎng)密度高達(dá)10⁷~10⁹CFU/mL也很難有污染跡象（渾濁、pH變化等）。支原體污染后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，狀態(tài)變差，不會(huì)馬上使細(xì)胞致死，但會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)的各種參數(shù)，如改變細(xì)胞膜抗原性，改變細(xì)胞新陳代謝，干擾核酸的合成，改變DNA轉(zhuǎn)染效率導(dǎo)致染色體畸變等。

支原體檢測(cè)方法有哪些？

檢測(cè)支原體的方法一般有分離培養(yǎng)法、指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）、化學(xué)發(fā)光法（特異酶學(xué)檢測(cè)）、ELISA法、PCR法。

1.  支原體分離培養(yǎng)法

支原體分離培養(yǎng)法是檢測(cè)支原體的金標(biāo)方法，其檢測(cè)精確度較高。此方法非常經(jīng)典，在世界范圍內(nèi)得到廣泛認(rèn)可，《中國(guó)藥典》2020版第四部分3301和歐洲藥典第六版2.6.7部分均有記載。這種方法是從可疑的細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣，并接種到培養(yǎng)基靈敏度檢查合格的支原體瓊脂培養(yǎng)基上，如果樣本中含有支原體，它們就會(huì)在支原體瓊脂基上生長(zhǎng)，較終形成明顯可見的特征性菌落。

由于分離培養(yǎng)法基本不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此也被譽(yù)為支原體檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。不過分離培養(yǎng)法也存在兩個(gè)弊端，一是檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)，支原體要在培養(yǎng)基上長(zhǎng)出明顯克隆需要4周左右，且操作也較復(fù)雜；二是盡管可以檢測(cè)絕大多數(shù)的支原體種類，但也存在個(gè)別無(wú)法檢測(cè)的情況，例如支原體M. hyorhinis。

2.  指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）

指示細(xì)胞培養(yǎng)法是指將供試品接種于指示細(xì)胞（一般選擇細(xì)胞質(zhì)區(qū)域較大無(wú)污染的Vero細(xì)胞或經(jīng)國(guó)家專業(yè)鑒定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其它細(xì)胞）中培養(yǎng)后，用特異熒光染料（如Hoechst染料）染色，然后在熒光顯微鏡下觀察。如供試品有支原體污染，就可以在指示細(xì)胞表面觀察到熒光斑點(diǎn)或熒光顆粒，與細(xì)胞核呈現(xiàn)的更大更亮橢圓形的熒光形成鮮明對(duì)比。

指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）也是《中國(guó)藥典》2020版第四部分3301認(rèn)可的支原體檢測(cè)方法，由于供試品要與指示細(xì)胞共同培養(yǎng)，因此也需要3~5天的時(shí)間。較大的優(yōu)點(diǎn)就是較為快速，直觀，但是它的靈敏度會(huì)比較低，在支原體污染不嚴(yán)重時(shí)容易得到模棱兩可的結(jié)果，只有在污染嚴(yán)重時(shí)才能得到可靠度較高的結(jié)果。此外Hoechst染色試劑對(duì)人體有害，要注意防護(hù)；且固定液含有冰乙酸，有刺激性氣味，需要在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行固定操作；熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當(dāng)天完成檢測(cè)。

3.  化學(xué)發(fā)光法（特異酶學(xué)檢測(cè)）

化學(xué)發(fā)光法的原理是利用支原體內(nèi)特有的酶，與提供的底物相互作用，使其中的ADP轉(zhuǎn)化為ATP，熒光素酶可以利用產(chǎn)生的ATP與熒光素酶底物發(fā)生反應(yīng)，能產(chǎn)生可以被儀器檢測(cè)到的光。如果沒有支原體存在，熒光素酶就沒有足夠的ATP去發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生光，儀器檢測(cè)到的數(shù)值就比較低；如果有支原體存在，就可以使大量的ADP轉(zhuǎn)化為ATP，供熒光素酶發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生大量的光，儀器檢測(cè)到的數(shù)值就比較高。

這種方法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)的靈敏度高，速度快，但只能檢測(cè)活的支原體。

4.  ELISA法

ELISA法也能用于支原體檢測(cè)，以ELISA法為基礎(chǔ)的支原體檢測(cè)一般使用針對(duì)支原體16S rRNA基因的帶標(biāo)記探針或抗體，也有一些商品化的支原體Elisa試劑盒來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)物中是否含有支原體。

ELISA法是一種很考驗(yàn)操作者技術(shù)的檢測(cè)方法，而且很依賴抗體，有一定局限性，無(wú)法對(duì)沒有抗體或目前找不到抗體的支原體進(jìn)行檢測(cè)，而且稍不留意就容易出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)誤差。方法相對(duì)復(fù)雜，用得也比較少。但是特異性高，時(shí)間也比較短，3~5小時(shí)就可以觀察結(jié)果。

5.  PCR法

PCR法也是目前較常用的方法，它的檢測(cè)方式主要有凝膠電泳檢測(cè)和熒光PCR定量檢測(cè)。其原理都是在支原體16S rRNA基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，通過檢測(cè)支原體DNA來(lái)檢測(cè)細(xì)胞中有無(wú)支原體的污染。

在凝膠電泳過程中，支原體DNA會(huì)顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。

在用熒光PCR定量擴(kuò)增時(shí)，觀察圖譜及C_t值可判斷是否有支原體存在。

PCR法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度高，特異性好，檢測(cè)速度快，可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)識(shí)別細(xì)胞培養(yǎng)物中是否有支原體污染。但存在測(cè)試過程中污染物易從陽(yáng)性對(duì)照（或其他以前對(duì)支原體測(cè)試呈陽(yáng)性的樣品）傳播到未受影響的樣品的風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，此外也不能判斷滅活處理后的樣品是否還有活的支原體。

支原體非常頑強(qiáng)，通常用于細(xì)胞培養(yǎng)的絕大多數(shù)抗生素都對(duì)其無(wú)效。無(wú)懈可擊的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)始終是預(yù)防支原體感染的較佳方式，另外及時(shí)找出受到支原體感染的培養(yǎng)物也很重要，這樣才能在感染擴(kuò)散前快速采取有效措施。

祝實(shí)驗(yàn)室各位小伙伴都能早日培養(yǎng)出自己心儀的細(xì)胞！